Page 47 - Chernik

DOI: https://doi.org/10.15414/2020.9788055222776

Черник М., Войналович Н., Сиренко Е., Пилипко Е. ‒ Патологии пчёл

заполненные спорами, которые давали основание поставить предварительный
диагноз на аскосфероз.
– выделение чистой культуры гриба из патматериала. Брали 1–2 погибшие
личинки и делали посев на один из видов питательного агара (2 % солодовый,
картофельно-декстрозный, Сабуро или сусловый). Перед посевом питательный
агар расплавляли на водяной бане и после охлаждения до 45–50 °С добавляли в
него 50 ЕД пенициллина или 100 ЕД стрептомицина на 1 мл среды для подавления
сопутствующей бактериальной флоры.
Поражённых личинок извлекали из ячеек, помещали в стерильную чашку
Петри, затем измельчали с помощью скальпеля и препаровальных игл. Частицы
размером до 1 мм раздельно помещали бактериологической петлей в чашки Петри
на питательную среду в 4–5 местах. Чашки помещали в термостат, где температура
не превышала 30°С, при которой достигалась наибольшая скорость роста колоний
и хорошее развитие всех структур гриба. За посевами наблюдали в течение 10
суток. Из выросших колоний приготавливали мазки, которые исследовали под
микроскопом, отмечая характерные для возбудителя морфологические признаки.
– выделение возбудителя из мёда. Навеску мёда (2 г) помещали в
центрифужную пробирку, добавляли 2–3 мл стерильного физиологического
раствора (35–40 °С) и центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную
жидкость удаляли, к осадку добавляли 2–3 мл физраствора и вторично
центрифугировали. Надосадочную жидкость сливали, а из полученного
центрифугата делались прямые посевы на питательную среду для последующего
выделения и микроскопии чистой культуры гриба.
– выделение возбудителя из перги и пыльцы:
а) Метод непосредственного посева. Пергу (пыльцу) небольшими кучками
(около 10 кучек) раскладывали по поверхности авизированной питательной
среды. Затем культивировали в термостате с последующим выделением чистой
культуры гриба и её микроскопией. При таком способе посева из большого
количества культивируемого материала прорастали в первую очередь грибы,
обладающие наибольшей энергией роста. Отсутствие изолированных колоний
вызывало затруднения для идентификации видов грибов и для проведения их
количественного учёта.
б) Метод разливки. Пергу или пыльцу массой около 10 г, измельчённую в
фарфоровой ступке, переносили в стерильную колбу, куда добавляли 90 мл
стерильной дистиллированной воды или физраствора. Периодически встряхивая
колбу, стеклянной палочкой добивались диспергирования пробы, затем делали
ряд дробных разведений до уровня 1:10000. Из каждого приготовленного
разведения проводили посевы на агаризированную питательную среду в 3–5
чашек Петри путем распределения по поверхности застывшей среды 1 мл взвеси с
помощью стеклянного шпателя Дригальского. Посевы помещали в термостат для
культивирования при температуре 28–32 °С. За ростом культуры наблюдали в
течение 5–10 дней.
При появлении характерных колоний гриба определяли индекс
обсеменённости исследованного материала, учитывая кратность разведения
взвеси, в посеве из которой выросло наименьшее число единичных колоний, по
формуле:
n * 10 *K
И  ,
о
M

46